Especificidade e funcao da metalopeptidase PHEX

Especificidade e funcao da metalopeptidase PHEX

Título alternativo Specificity and function of the metalopeptidase PHEX
Autor Campos, Marcelo Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo O gene PHEX (phosphate-regulating gene with homologies to endopeptidases on the X chromosome) codifica uma proteina com homologia estrutural com os membros da familia M13 de metalo-peptidases. Mutacoes no gene PHEX sao responsaveis pela hipofosfatemia ligada ao cromossomo X (XLH), a forma mais prevalente de raquitismo hereditario em humanos, caracterizada por retardo no crescimento, osteomalacia, hipofosfatemia e defeitos renais de reabsorcao de fosfato e metabolismo da vitamina D. Entretanto, o mecanismo pelo qual a perda da funcao da PHEX resulta no fenotipo da doenca e os substratos endogenos da PHEX permanecem desconhecidos. Os objetivos deste trabalho foram estudar a especificidade da PHEX e desenvolver um metodo de ensaio rapido e sensivel para deteccao da atividade enzimatica utilizando substratos peptidicos com apagamento intramolecular da fluorescencia. Para isso, bibliotecas combinatorias de peptideos fluorogenicos foram sintetizadas e testadas como substratos da PHEX. Diferentemente dos outros membros da familia M13, a PHEX mostrou um restrita especificidade por residuos de aminoacidos acidicos (Asp ou Glu) no subsitio S'1, com uma forte preferencia por Asp. Os subsitios S'2, S1 and S2 apresentaram especificidades menos definidas, mas a presenca de Leu, Pro ou Gly em P'2 ou Val, Ile or His in P1 impediram a hidrolise do substrato pela enzima. Tambem, usando peptideos fluorogenicos derivados das sequencias do FGF-23 e MEPE flanqueados pelo Abz e EDDnp, mostramos que estas proteinas fisiologicamente relevantes sao potenciais substratos da PHEX. Alem disso, nossos resultados claramente indicam que a PHEX nao tem uma especificidade NEP-like. Desenvolvemos tambem um peptideo de apagamento intramolecular de fluorescencia (Abz-GFRDWK(Dnp)-OH), que nos permitiu caracterizar a atividade peptidasica de oito diferentes mutantes da PHEX (as mesmas mutacoes sao encontradas em pacientes com XLH) obtidas por mutagenese sitio-dirigida. Usando este substrato, observamos que algumas proteinas PHEX mutantes apresentaram atividades hidroliticas totais ou parciais e outras foram totalmente inativas. Uma das proteinas PHEX mutantes apresentou atividade hidrolitica parcial com concomitante alteracao conformacional
Palavra-chave Substratos
Fluorescência
Hipofosfatemia
Especificidade por Substrato
Idioma Português
Data de publicação 2004
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2004. 88 p.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 88 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/18731

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