Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de tripsina isolado de sementes de Bauhinia variegata

Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de tripsina isolado de sementes de Bauhinia variegata

Título alternativo Cloning, expression and characterization of a trypsin inhibitor from Bauhinia variegata seeds
Autor Souza, Adriana Florentino de Autor UNIFESP Google Scholar
Orientador Sampaio, Claudio Augusto Machado Autor UNIFESP Google Scholar
Resumo Ha mais de uma decada que os inibidores vegetais de proteases, principalmente aqueles envolvidos no processo de coagulacao sanguinea, vem sendo estudados em nosso grupo. Ao longo desses anos, varios inibidores extraidos de sementes do genero Bauhinia foram purificados e sequenciados. Esses inibidores apresentam alta homologia e algumas diferencas na inibicao de serinoproteases. O inibidor de tripsina isolado das sementes de Bauhinia variegata (BvTI) apresenta alta homologia com o inibidor de Fator Xa isolado das sementes de Bauhinia ungulata (BuXI). No entanto, o Bvrl nao apresenta inibicao sobre o Fator Xa. A comparacao das estruturas primarias do BvTI e BuXI indica que ha diferenca em alguns residuos de aminoacidos na regiao do sitio reativo (Oliva et ai., 1996). O emprego de tecnicas de quimica de proteinas nos forneceram dados substanciais a respeito da especificidade dessas proteinas para que entao pudessemos dar um novo enfoque ao estudo desses inibidores utilizando tecnicas de biologia molecular e assim, pudessemos tentar esclarecer a especificidade desses inibidores da familia Kunitz para diferentes serinoproteases. Para tanto resolvemos: ' - Clonar e expressar o gene de um BvTI, inibidor de tripsina isolado das sementes de Bauhinia variegata, e a regiao do sitio reativo do BvTI, RS-BvTI, ativos na superficie de fago filamentoso, empregando o Sistema Phage Display; - Estabelecer um sistema de expressao para o BvTI em E. coli, utilizando o vetor pET-14b; Por fim, caracterizar as proteinas recombinantes. Para a clonagem molecular do BvTI, primeiramente foi realizada a extracao do RNA total das sementes prematuras de B. variegata, que foi empregado como molde para a sintese do cDNA fita dupla, empregando-se tecnicas de RT-PCR e PCR. O cDNA fita dupla foi clonado ao fagomideo pCANTAB 5E e utilizado para a transformacao de bacterias TG1. O clone pAS 1.1.3 teve a sequencia de seu inserto determinada pelo sequenciamento de nucleotideos, o qual revelou um cDNA de 733 pb, incluindo o gene codificador de um BvTI (175 aa). A comparacao da sequencia de aminoacidos deduzida do BvTI clonado com outros inibidores isolados de Bauhinia revelou a autenticidade do gene clonado...(au)
Palavra-chave Inibidores da Tripsina
Serina Endopeptidases
Clonagem Molecular
Fabaceae
Sementes
Trypsin Inhibitors
Serine Endopeptidases
Cloning, Molecular
Fabaceae
Seeds
Idioma Português
Data de publicação 2001
Publicado em São Paulo: [s.n.], 2001. 137 p. ilustab.
Publicador Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extensão 137 p.
Direito de acesso Acesso restrito
Tipo Tese de doutorado
Endereço permanente http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/17692

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