Purificação e caracterização de duas aminopeptidases de sementes de Zea mays

Abstract

As aminopeptidases estao amplamente distribuidas, tanto no reino animal como no vegetal. Elas sao enzimas que hidrolisam ligacoes peptidicas da porcao N-terminal de peptideos, e tambem hidrolisam aminoacil-a-naftilamidas (AA-NA) e aminoacil-p-nitroanilidas (AA-Nan). A atividade aminopeptidasica e encontrada somente nas regioes do embriao e aleurona das sementes de Zea mays. Tambem foi verificado que o extrato de embrioes apresenta maior quantidade de atividade aminopeptidasica por grama do que o extrato de cotiledones. Do sobrenadante do extrato de embrioes, duas enzimas foram purificadas (LAP e RAP) por cromatografia de troca ionica, gel filtracao e interacao hidrofobica. As duas enzimas foram separadas somente pela ultima cromatografia. Na SDS-PAGE, as duas aminopeptidases apresentaram somente uma banda proteica cada, na presenca ou na ausencia de agente redutor, ambas com massa moleculare de 110 kDa. A homogeneidade da LAP foi verificada por HPLC em coluna C-18, sendo eluido apenas um pico proteico com 53,705 min de tempo de retencao, primeiramente com um gradiente linear simultaneo de concentracao de acetonitrila (4,5 - 6,3 por cento) e isopropanol (1 ,5 - 9 por cento), seguido por 90 por cento de acetonitrila em 0,1 por cento de TFA em agua. A homogeneidade da RAP foi verificada por HPLC em resina C-4, sendo eluido apenas um pico proteico com 51,785 min de tempo de retencao, com um gradiente linear de concentracao de acetonitrila (0 - 90 por cento) em 0,1 por cento de TFA em agua. A LAP de embrioes de milho apresentou valores de KM da ordem de 10-SM para Leu-NA e 10-4M para Met-NA, e nao apresentou atividade sobre Ala-, Arge Glu-NA. Os valores de efiCiência catalitica (VmaX/KM) mostraram que Leu-NA e 25 vezes melhor substrato do que Met-NA. A LAP apresentou as seguintes caracteristicas: pH otimo 7,0; estabilidade a -20, 4 e 25§C por pelo menos 30 dias; absorcao maxima de luz a 595 nm; ativacao por a-mercaptoetanol e ditioeritritol; leve inibicao por ions sodio e calcio; inibicao por ions cobalto e pOHMB; sem inibicao por EDTA, o-PHE, aminoacidos, o-naftilamina, pnitroanilina e bestatina. A RAP de embrioes de milho apresentou valores de KM da ordem de 10-5M para Arg- e Leu-NA e 10-4M para Ala- e Met-NA. Os valores de efiCiência catalitica (Vmax/Kna) mostraram que Arg-NA e cerca de 3 vezes melhor substrato do que Leu-NA; 33 vezes melhor do que Met-NA e 50 vezes melhor do que Ala-NA. A RAP e ativada por ions cloreto e magnesio, nao e inibida por...(au)