Purificacao e caracterizacao parcial de aminopeptidase do homogenato de rim de coelho

Purificacao e caracterizacao parcial de aminopeptidase do homogenato de rim de coelho

Author Oliveira, Sonia Maria de Autor UNIFESP Google Scholar
Abstract As aminopeptidases estao amplamente distribuidas tanto no reino animal como no vegetal e sao capazes de hidrolisar ligacoes peptidicas na porcao amino-terminal de peptideos, alem de hidrolisar aminoacil-β-naftilamidas (AA-NA) e aminoacil-p-nitroanilidas (AA-Nan). Do homogenato de rim de coelho, tratado com Triton X-100, foram purificadas, por cromatografia de troca ionica e gel filtracao, tres aminopeptidases distintas: a primeira nao retida na coluna de DEAE-celulose Cellex D, equilibrada com tampao fosfato de sodio 0,02 M pH 7,0; a segunda e a terceira eluidas com gradiente linear de tampao fosfato de sodio 0,02 a 0,3 M pH 7,0, em condutancia 0,5 e 0,9 mS, respectivamente. A gel filtracao destas aminopeptidases, em coluna de Bio gel A0,5m equilibrada com tampao fosfato 0,02 M pH 7,0, apresentou, em cada cromatografia, apenas um pico proteico com atividade sobre AA-NA. Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, em presenca e ausencia de redutor, apresentou apenas uma banda proteica, com peso molecular 70, 78 e 54 k. Da para a primeira, segunda e terceira enzima, respectivamente. A primeira aminopeptidase apresentou valores de KM da ordem de 10-5 M para Ala-, Leu-, Met- e Arg-NA. O melhor substrato, dado pela efiCiência catalitica (Vmax / KM) foi a Met-NA, sendo entao denominada de metionina aminopeptidase (MAP). A MAP de rim de coelho apresentou as seguintes caracteristicas: pH otimo 7,0, inibicao por ions Co2+ e Zn2+, p-OHMB e succinato de hidrocortisona sodica; inibicao parcial por o-PHE e pouco ou nenhuma inibicao pelos ions cloreto, Ca2+, Mg2+ e Mn2+, por EDTA, β-ME, DTT, Leu, Arg, Met, Ala, p-nitroanilina, β-naftilamina, desoxicolato, indometacina , bestatina e puromicina. A segunda aminopeptidase apresentou valores de KM da ordem de 10-5 M para Ala-, Arg-, Leu- e Met-NA. O melhor substrato para essa enzima, dado pela relacao (Vmax / KM) foi a Arg-NA, sendo entao denominada de arginil aminopeptidase (ARG-AP). A Arg-AP de rim de coelho apresentou as seguintes caracteristicas: pH otimo 7,0; ativacao por ions cloreto; inibicao parcial por ions Mn2+ e Zn2+, por succinato de hidrocortisona sodica; inibicao por o-PHE e desoxicolato de sodio; pouco ou nenhuma inibicao por ions Ca2+, Mg2+, EDTA, β-ME, DTT, p-OHMB, Leu, Ala, Arg, Met, p-nitroanilina, β-naftilamina e indometacina. A Arg-NA e inibida competitivamente por bestatina e puromicina, com valores de Ki da ordem de 10-6 e 10 4, respectivamente. A terceira aminopeptidase apresentou valores de KM da ordem de 10-5 M para a Ala-NA e 10-6 M para Arg-, Leu- e Met-NA. Como o melhor substrato, verificado atraves da efiCiência catalitica, foi Leu-NA, a enzima passou a ser chamada de leucil aminopeptidase (LAP). A LAP de rim de coelho tem pH otimo 7,0, sendo inibida parcialmente por ions Zn2+, p-nitroanilina, succinato de hidrocortisona sodica e indometacina; inibida por EDTA, o-PHE, p-OHMB, desoxicolato de sodio. Foi pouco ou nao inibida pelos ions Ca2+, Co2+, Mg2+ e Mn2+, por β-ME, DTT, Leu, Arg, Ala, Met e β-naftilamina. A LAP e inibida competitivamente por bestatina e puromicina com valores de Ki da ordem de 10-7 e 10-6 M, respectivamente
Keywords Animais
Aminopeptidases
Rim
Coelhos
Animais
Language Portuguese
Date 1997
Published in São Paulo: [s.n.], 1997. 105 p.
Publisher Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
Extent 105 p.
Access rights Closed access
Type Dissertation
URI http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/15450

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